Zyklische Amplifikation von Proteinfehlfalten - Wikipedia

Zyklische Amplifikation der Proteinfehlfaltung ( PMCA ) ist eine Amplifikationstechnik (konzeptuell wie PCR, jedoch nicht mit Nukleotiden), um missgefaltete Prionen, die ursprünglich von Soto und Kollegen entwickelt wurden, zu multiplizieren. ^[1] Es ist ein Test für spongiforme Enzephalopathien wie BSE.

Technik [ edit ]

Die Technik inkubiert anfangs eine kleine Menge anormalen Prions mit einem Überschuss an normalem Protein, so dass eine gewisse Umwandlung stattfindet. Die wachsende Kette von missgefaltetem Protein wird dann mit Ultraschall gesprengt, zerlegt es in kleinere Ketten und erhöht so schnell die Menge an anomalem Protein, die für Umwandlungen zur Verfügung steht. ^[1][2] Durch Wiederholung des Zyklus wird die Masse des normalen Proteins schnell in ein falsch gefaltetes Protein umgewandelt Prion (PrPSc genannt). Entwicklung

Entwicklung [ edit ]

PMCA wurde ursprünglich entwickelt, um die Prionenreplikation in vitro mit einer ähnlichen Effizienz wie der in vivo-Prozess zu simulieren, jedoch mit beschleunigter Kinetik. ^[1] PMCA ist konzeptionell analog zur DNA-Amplifikation durch PCR. In beiden Systemen wächst eine Vorlage auf Kosten eines Substrats in einer zyklischen Reaktion, wobei Wachstum und Multiplikation der Vorlageneinheiten kombiniert werden.

Replikation [ edit ]

PMCA wurde angewendet, um das falsch gefaltete Protein aus verschiedenen Spezies zu replizieren. ^[3][4][5] Das neu erzeugte Protein weist die gleichen biochemischen, biologischen und strukturellen Eigenschaften auf aus dem Gehirn stammendes PrPSc, und auffallend ist es infektiös für Wildtyp-Tiere, die eine Krankheit mit ähnlichen Eigenschaften wie die durch durch das Gehirn isolierte Prionen hervorgerufene Krankheit erzeugen. ^[6]

Automation [

The Die Technologie wurde automatisiert, was zu einer dramatischen Steigerung der Effizienz der Verstärkung führte. Tatsächlich führt eine PMCA-Zyklusrunde zu einer 2500fachen Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit gegenüber dem Western-Blotting, ^[7] wohingegen 2 und 7 Runden aufeinanderfolgender PMCA-Zyklen zu einer 6- bis 3fachen Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit führen Western Blotting, eine Technik, die in der BSE-Überwachung in mehreren Ländern weit verbreitet ist. ^[7]

Sensitivität [ edit

Es wurde gezeigt, dass PMCA nur ein einziges Molekül von MAK erkennen kann Oligomeres infektiöses PrPSc. ^[7] PMCA besitzt die Fähigkeit, Millionen infektiöse Einheiten zu erzeugen, beginnend mit dem Äquivalent eines PrPSc-Oligomers; weit unterhalb der Infektiositätsschwelle. ^[7] Diese Daten zeigen, dass PMCA eine ähnliche Amplifikationsstärke aufweist wie PCR-Techniken zur DNA-Amplifikation. Dies eröffnet vielversprechende Möglichkeiten für die Entwicklung eines hochsensiblen PrPSc-Nachweises und für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Prionenreplikation. In der Tat wurde PMCA von verschiedenen Gruppen für PrPSc im Blut von Tieren verwendet, die experimentell mit Prionen infiziert waren, und zwar sowohl in der symptomatischen ^[8] - als auch in der vorsymptomatischen Phase ^[9] sowie im Urin. ^[10]

Die PMCA-Technologie wurde von verwendet mehrere Gruppen, um den molekularen Mechanismus der Prionenreplikation zu verstehen, die Art des Infektionserregers, das Phänomen der Prionenstämme und die Barriere der Spezies, die Wirkung zellulärer Komponenten, den Nachweis von PrPSc in Geweben und biologischen Flüssigkeiten und das Screening auf Inhibitoren der Prionenreplikation. ^{[11][12][13][14][15][16][17][18][19][20][21][22][23][24][25][26][27][28][29][30][31][32][33][34]} Kürzlich durchgeführte Studien der Supattapon- und Ma-Gruppen waren in der Lage, die Prionenreplikation in vitro mittels PMCA unter Verwendung von gereinigter PrPC und rekombinanter PrPC unter alleiniger Zugabe von synthetischen Polyanionen und Lipiden zu erzeugen. ^[35][36] Diese Studien haben gezeigt, dass infektiöse Prionen möglich sind produziert in Abwesenheit irgendeiner anderen zellulären Komponente und stellen einige der stärksten Beweise für die Prion-Hypothese dar.

Referenzen [ edit ]

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