Einzelmolekül-Experiment - Wikipedia

Einzelne Polymermoleküle (0,4 nm dicke Ketten), aufgenommen unter wässrigem Medium bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung eines AFM. Eine drastische Änderung der Konformation der Polymerkette wird bei einer geringen Änderung des pH-Werts beobachtet. ^[1]

Ein Einzelmolekülexperiment ist ein Experiment, das die Eigenschaften einzelner Moleküle untersucht. Einzelmolekülstudien können mit Messungen an einem Ensemble oder einer Ansammlung von Molekülen verglichen werden, bei denen das individuelle Verhalten von Molekülen nicht unterschieden werden kann und nur durchschnittliche Eigenschaften gemessen werden können. Da viele Messtechniken in der Biologie, Chemie und Physik nicht empfindlich genug sind, um Einzelmoleküle zu beobachten, haben Einzelmolekülfluoreszenztechniken (die seit den 1990er Jahren zum Untersuchen verschiedener Prozesse auf der Ebene der Einzelmoleküle entwickelt wurden) eine große Erregung ausgelöst, da diese eine große Aufregung darstellen lieferte viele neue Details zu den gemessenen Prozessen, die in der Vergangenheit nicht zugänglich waren. Tatsächlich wurden seit den 1990er Jahren viele Techniken entwickelt, um einzelne Moleküle zu untersuchen. ^[2]

Bei den ersten Einzelmolekülexperimenten handelte es sich um Patch-Clamp-Experimente, die in den 1970er Jahren durchgeführt wurden. Diese waren jedoch auf die Untersuchung von Ionenkanälen beschränkt. Heutzutage umfassen Systeme, die mit Einzelmolekülverfahren untersucht wurden, die Bewegung von Myosin auf Aktinfilamenten im Muskelgewebe und die spektroskopischen Details einzelner lokaler Umgebungen in Festkörpern. Die Konformationen biologischer Polymere wurden mit der Rasterkraftmikroskopie (AFM) gemessen. Mithilfe der Kraftspektroskopie können einzelne Moleküle (oder Paare interagierender Moleküle), normalerweise Polymere, mechanisch gedehnt und ihre elastische Reaktion in Echtzeit aufgezeichnet werden.

Geschichte [ edit ]

In der Gasphase bei ultratiefem Druck gibt es Einzelmolekülexperimente seit Jahrzehnten, aber erst seit 1989 in der kondensierten Phase mit der Arbeit von WE Moerner und Lothar Kador. ^[3] Ein Jahr später gelang es Michel Orrit und Jacky Bernard, den Nachweis der Absorption einzelner Moleküle anhand ihrer Fluoreszenz zu zeigen. ^[4]

Viele Techniken können die meisten Moleküle gleichzeitig beobachten insbesondere Massenspektrometrie, bei der einzelne Ionen nachgewiesen werden. Als eines der ersten Mittel zur Detektion einzelner Moleküle kam außerdem die Entwicklung der Patch-Clamp-Technik von Erwin Neher und Bert Sakmann (die später den Nobelpreis für ihre wegweisenden Beiträge erhielten) im Bereich der Ionenkanäle hervor. Die Idee der Leitfähigkeitsmessung bei der Betrachtung einzelner Moleküle stellte jedoch die Art der beobachtbaren Systeme stark ein.

Fluoreszenz ist ein bequemes Mittel zum Beobachten eines Moleküls zu einem Zeitpunkt, hauptsächlich aufgrund der Empfindlichkeit kommerzieller optischer Detektoren, die in der Lage sind, einzelne Photonen zu zählen. Die Beobachtung eines Moleküls erfordert jedoch spektroskopisch, dass sich das Molekül in einer isolierten Umgebung befindet und bei Anregung Photonen emittiert, die dank der Technologie zum Nachweis einzelner Photonen mithilfe von Photomultiplier-Röhren (PMT) oder Avalanche-Photodioden (APD) ermöglicht die Aufzeichnung von Photonenemissionsereignissen mit großer Empfindlichkeit und zeitlicher Auflösung.

In jüngerer Zeit ist die Einzelmolekülfluoreszenz für die biologische Bildgebung von großem Interesse, da Biomoleküle wie Proteine ​​und Nukleotide markiert werden, um die enzymatische Funktion zu untersuchen, die aufgrund der subtilen Zeitabhängigkeit nicht leicht im Bulk-Maßstab untersucht werden kann Bewegungen in der Katalyse und strukturellen Neuordnung. Das am meisten untersuchte Protein war die Klasse der Myosin / Actin-Enzyme, die im Muskelgewebe gefunden werden. Durch Einzelmolekülverfahren wurde der Schrittmechanismus in vielen dieser Proteine ​​beobachtet und charakterisiert.

Nanomanipulatoren wie das Atomic-Force-Mikroskop eignen sich auch für Einzelmolekülexperimente mit biologischer Bedeutung, da sie auf der gleichen Längenskala der meisten biologischen Polymere arbeiten. Die Atomkraftmikroskopie (AFM) eignet sich außerdem für die Untersuchung synthetischer Polymermoleküle. AFM bietet eine einzigartige Möglichkeit der 3D-Visualisierung von Polymerketten. Zum Beispiel ist der AFM-Abgriffsmodus schonend genug, um adsorbierte Polyelektrolytmoleküle (beispielsweise 0,4 nm dicke Ketten von Poly (2-vinylpyridin)) unter einem flüssigen Medium aufzuzeichnen. Der Ort der Zwei-Ketten-Überlagerung entspricht in diesen Experimenten der doppelten Dicke der Einzelkette (0,8 nm im Fall des genannten Beispiels). Bei Anwendung geeigneter Abtastparameter bleibt die Konformation solcher Moleküle stundenlang unverändert, was die Durchführung von Experimenten unter flüssigen Medien mit verschiedenen Eigenschaften ermöglicht. ^[1] Ferner können durch Steuerung der Kraft zwischen der Spitze und der Probe hochauflösende Bilder hergestellt werden erhalten. ^[5][6] Optische Pinzetten wurden auch verwendet, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen und zu quantifizieren. ^[5][6]

Über die Experimente [ edit

Concept ]

Die Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie nutzt die Fluoreszenz eines Moleküls, um Informationen über seine Umgebung, Struktur und Position zu erhalten. Die Technik bietet die Möglichkeit, Informationen zu erhalten, die ansonsten aufgrund der Mittelwertbildung im Ensemble nicht verfügbar sind (das heißt, ein Signal, das erhalten wird, wenn viele Moleküle gleichzeitig aufgenommen werden, stellt eine durchschnittliche Eigenschaft der Dynamik der Moleküle dar). Die Ergebnisse vieler Experimente mit einzelnen Molekülen sind Flugbahnen in zwei Zuständen.

Einkanalaufzeichnung [ edit ]

Zwei Beispiele von Daten (jeweils ~ 10 s) aus einem Einkanalaufzeichnungsexperiment unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik. Die obere Spur ist bei einer niedrigeren Konzentration, während die untere Spur bei einer Agonistenkonzentration nahe der EC dieses Ionenkanals ₅₀ aufgezeichnet wird. Kanalöffnungen werden durch Ablenkungen nach unten dargestellt, in diesem Fall Ablenkungen von ungefähr 5 pA.

Wie bei der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie kann die als Einkanalaufzeichnung bekannte Technik verwendet werden, um spezifische kinetische Informationen - in diesem Fall etwa - zu erhalten Ionenkanalfunktion - diese Funktion steht nicht zur Verfügung, wenn Ensemble-Aufnahmen wie die Ganzzellenaufzeichnung durchgeführt werden. ^[7] Konkret wechseln Ionenkanäle zwischen leitenden und nichtleitenden Klassen, die sich in der Konformation unterscheiden. Daher kann der Funktionszustand von Ionenkanälen mit ausreichend empfindlicher Elektronik direkt gemessen werden, vorausgesetzt, dass geeignete Vorkehrungen zur Minimierung des Rauschens getroffen werden. Jede dieser Klassen kann wiederum in einen oder mehrere kinetische Zustände unterteilt werden, wobei die zugrunde liegende Funktion des Ionenkanals direkt beeinflusst wird. Das Durchführen dieser Arten von Einzelmoleküluntersuchungen unter systematisch variierenden Bedingungen (z. B. Agonistenkonzentration und -struktur, Permeation eines Ionen- und / oder Kanalblockers, Mutationen in den Ionenkanalaminosäuren) kann Informationen bezüglich der Umwandlung verschiedener kinetischer Zustände des Ionenkanals liefern. In einem Minimalmodell für einen Ionenkanal gibt es zwei Zustände: offen und geschlossen. Es werden jedoch häufig andere Zustände benötigt, um die Daten genau darzustellen, einschließlich mehrerer geschlossener Zustände sowie inaktiver und / oder desensibilisierter Zustände, bei denen es sich um nichtleitende Zustände handelt, die sogar in Gegenwart von Stimulus auftreten können. ^[7]

Biomolecule-Markierung [ edit ]

Einzelne Fluorophore können chemisch an Biomoleküle wie Proteine ​​oder DNA gebunden werden, und die Dynamik einzelner Moleküle kann durch Überwachung der Fluoreszenzsonde verfolgt werden. Räumliche Bewegungen innerhalb der Rayleigh-Grenze können zusammen mit Änderungen der Emissionsintensität und / oder der Strahlungslebensdauer verfolgt werden, die häufig auf Änderungen in der lokalen Umgebung hinweisen. Zum Beispiel hat die Markierung von Einzelmolekülen eine große Menge an Informationen darüber ergeben, wie sich Kinesin-Motorproteine ​​entlang von Mikrotubuli-Strängen in Muskelzellen bewegen.

Einzelmolekülfluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) [ edit

Beim Einzelmolekülfluoreszenzresonanzenergietransfer wird das Molekül an mindestens zwei Stellen markiert. Ein Laserstrahl fokussiert auf das Molekül, das die erste Sonde erregt. Wenn sich diese Sonde entspannt und ein Photon emittiert, besteht die Chance, dass die andere Sonde angeregt wird. Die Effizienz der Absorption des von der ersten Sonde in der zweiten Sonde emittierten Photons hängt von dem Abstand zwischen diesen Sonden ab. Da sich der Abstand mit der Zeit ändert, untersucht dieses Experiment die innere Dynamik des Moleküls.

Einzelmolekülexperimente versus Ensembleexperimente [ edit ]

Bei der Betrachtung von Daten, die sich auf einzelne Moleküle beziehen, kann man gewöhnlich Propagatoren und Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen der ersten Zeit konstruieren Ordnung, die zweite Ordnung usw., während man aus Massenexperimenten gewöhnlich den Zerfall einer Korrelationsfunktion erhält. ^[8] Aus den Informationen dieser einzigartigen Funktionen (die von einzelnen Molekülen erhalten werden) kann man ein relativ klares Bild gewinnen wie sich das System verhält; z.B. sein kinetisches Schema oder sein Aktivitätspotential oder seine reduzierten Dimensionen bilden. ^[9][10] Insbesondere kann man (viele Eigenschaften eines) den Reaktionsweg eines Enzyms konstruieren, wenn man die Aktivität eines einzelnen Enzyms überwacht. ^[11] Wichtige Aspekte für die Analyse von Einzelmoleküldaten - wie Anpassungsmethoden und Tests für homogene Populationen - wurden von mehreren Autoren beschrieben. ^[7] Andererseits gibt es mehrere Probleme bei der Analyse von Einzelmoleküldaten, einschließlich der Konstruktion von a rauscharme Umgebung und isolierte Pipettenspitzen, zum Filtern einiger verbleibender unerwünschter Komponenten (Rauschen) in Aufzeichnungen und Zeitaufwand für die Datenanalyse (Vorverarbeitung, eindeutige Ereigniserkennung, Zeichnen von Daten, Anpassen kinetischer Schemata usw.) .

Einzelmolekülverfahren beeinflussten Optik, Elektronik, Biologie und Chemie. In den Biowissenschaften beschränkte sich die Untersuchung von Proteinen und anderer komplexer biologischer Maschinerie auf Experimente, die die direkte Beobachtung ihrer Kinetik nahezu unmöglich machten. Zum Beispiel wurde die direkte Beobachtung der Gehmechanismen erst nach der Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von Kinesin-Myosin-Paaren im Muskelgewebe verstanden. Diese Experimente waren jedoch größtenteils auf In-vitro-Studien beschränkt, da nützliche Techniken für das Live-Cell-Imaging noch nicht vollständig realisiert wurden. Das Versprechen der Einzelmolekül-In-vivo-Bildgebung ^[12] birgt jedoch ein enormes Potenzial, Biomoleküle in nativen Prozessen direkt zu beobachten. Diese Techniken zielen häufig auf Studien mit Proteinen mit geringer Kopienzahl ab, von denen viele noch entdeckt werden. Diese Techniken wurden auch auf Bereiche der Chemie einschließlich der Kartierung heterogener Oberflächen erweitert. ^[13]

Siehe auch [ ]

. Referenzen [ ]]

1. ^ ^{a b} Y. Roiter und S. Minko, AFM-Einzelmolekülversuche an der Fest-Flüssig-Grenzfläche: In situ-Konformation adsorbierter flexibler Polyelektrolytketten, Journal der American Chemical Society, vol. 127, iss. 45, S. 15688–15689 (2005)
2. ^ Juette, MF; Terry, DS; Wasserman, MR; Zhou, Z; Altman, RB; Zheng, Q; Blanchard, SC (Juni 2014). "Die glänzende Zukunft der Einzelmolekülfluoreszenzbildgebung". Curr Opin Chem Biol . 20 : 103–11. Doi: 10.1016 / j.cbpa.2014.05.010. PMC 4123530 . PMID 24956235.
3. ^ W. E. Moerner und L. Kador, Optischer Nachweis und Spektroskopie einzelner Moleküle in einem Festkörper, Phys. Rev. Lett. 62, 2535 - 2538 (1989)
4. ^ M. Orrit und J. Bernard, Einzelne Pentacenmoleküle, die durch Fluoreszenzanregung in einem p -terphenylkristall, Phys. Rev. Lett. 65, 2716–2719 (1990)
5. ^ ^{a b} d. Murugesapillai et al. DNA-Brückenbildung und -schleifen durch HMO1 stellt einen Mechanismus zur Stabilisierung von nucleosomenfreiem Chromatin bereit, Nucleic Acids Res (2014) 42 (14): 8996-9004
6. ^{a ] b} Murugesapillai, D .; et al. (2016). "Einzelmolekülstudien mit DNA-Biegeproteinen der Gruppe B mit hoher Mobilität". Biophys Rev . 9 (1): 17–40. doi: 10.1007 / s12551-016-0236-4. PMC 5331113 . PMID 28303166.
7. ^ ^{a b c} B. Sakmann und E. Neher, Single-Channel Recording ISBN 9780306414190 (1995).
8. ^ O. Flomenbom, J. Klafter und A. Szabo, Was kann man aus zwei Einzelzuständen von Einzelmolekülen lernen? Archiviert am 14. Januar 2012 bei der Wayback Machine, Biophys. J. 88, 3780–3783 (2005); q-bio / 0502006
9. ^ O. Flomenbom und R. J. Silbey, Nutzung des Informationsinhalts in Zwei-Zustands-Flugbahnen Archiviert am 14. Januar 2012 bei der Wayback Machine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10907–10910 (2006).
10. ^ O. Flomenbom und R. J. Silbey, Toolbox zur Analyse von endlichen Zwei-Zustands-Flugbahnen, Phys. Rev. E 78, 066105 (2008); arXiv: 0802.1520.
11. ^ O. Flomenbom, K. Velonia, D. Loos, et al., Exponentialer Zerfall und Korrelationen der katalytischen Aktivität von fluktuierenden einzelnen Lipasemolekülen. Archiviert am 14. Januar 2012, Wayback Machine, Proc. Natl. Acad. Sci. US 102, 2368–2372 (2005).
12. Zhan, Hong; Stanciauskas, Ramunas; Stigloher, Christian; Dizon, Kevin K .; Jospin, Maelle; Bessereau, Jean-Louis; Pinaud, Fabien (2014). "In-vivo-Einzelmolekül-Imaging identifiziert veränderte Dynamiken von Calciumkanälen in Dystrophin-Mutanten C. elegans". Nature Communications . 5 : ncomms5974. Bibcode: 2014NatCo ... 5E4974Z. doi: 10.1038 / ncomms5974. PMC 4199201 . PMID 25232639.
13. ^ Walder, R .; Nelson, N .; Schwartz, D. K. (2011). "Hochauflösendes Oberflächenmapping unter Verwendung der Flugbahnen molekularer Sonden". Nature Communications . 2 : 515. Bibcode: 2011NatCo ... 2E.515W. doi: 10.1038 / ncomms1530. PMID 22044994.