Assay zur Bestimmung der elektrophoretischen Mobilität - Wikipedia

Spur 1 ist eine negative Kontrolle und enthält nur genetisches Material. Spur 2 enthält Protein sowie ein DNA-Fragment, das aufgrund seiner Sequenz nicht interagiert. Spur 3 enthält Protein und ein DNA-Fragment, das reagiert; Der resultierende Komplex ist größer, schwerer und langsamer. Das in Spur 3 gezeigte Muster ist das Muster, das sich ergeben würde, wenn die gesamte DNA gebunden wäre und keine Dissoziation des Komplexes während der Elektrophorese auftrat. Wenn diese Bedingungen nicht erfüllt sind, könnte in Spur 3 eine zweite Bande zu sehen sein, die die Anwesenheit von freier DNA oder die Dissoziation des DNA-Protein-Komplexes widerspiegelt.

Ein elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungsassay (EMSA) oder Mobilitätsverschiebungselektrophorese auch als Gelverschiebungsassay Mobilitätsverschiebungsassay 19459019, 19459019, Bandverschiebungsassay oder 19459019 oder 19459009 bezeichnet Assay ist eine übliche Affinitätselektrophoresetechnik zur Untersuchung von Protein-DNA- oder Protein-RNA-Wechselwirkungen. Dieses Verfahren kann bestimmen, ob ein Protein oder ein Proteingemisch in der Lage ist, an eine bestimmte DNA- oder RNA-Sequenz zu binden, und kann manchmal anzeigen, ob mehr als ein Proteinmolekül am Bindungskomplex beteiligt ist. Gel-Shift-Assays werden häufig in vitro gleichzeitig mit DNase-Footprinting-, Primer-Extension- und Promoter-Probe-Experimenten durchgeführt, wenn die Transkriptionsinitiierung, DNA-Replikation, DNA-Reparatur oder RNA-Prozessierung und -Reinigung sowie das Spleißen vor der mRNA untersucht werden ^[1]. Obwohl Vorläufer in der früheren Literatur zu finden sind, basieren die meisten aktuellen Assays auf Methoden, die von Garner und Revzin ^[2] und Fried und Crothers ^[3]

beschrieben werden. Prinzip [ edit

A Mobilität Shift-Assay ist die elektrophoretische Auftrennung eines Protein-DNA- oder Protein-RNA-Gemisches auf einem Polyacrylamid- oder Agarosegel für einen kurzen Zeitraum (etwa 1,5 bis 2 Stunden für ein 15 bis 20-cm-Gel). ^[4] Die Geschwindigkeit, bei der sie sich unterscheiden Moleküle (und Kombinationen davon), die sich durch das Gel bewegen, werden durch ihre Größe und Ladung und in geringerem Maße von ihrer Form bestimmt (siehe Gelelektrophorese). Die Kontrollspur (DNA-Sonde ohne vorhandenes Protein) enthält eine einzelne Bande, die dem ungebundenen DNA- oder RNA-Fragment entspricht. Vorausgesetzt jedoch, dass das Protein in der Lage ist, an das Fragment zu binden, wird die Spur mit einem vorhandenen Protein eine andere Bande enthalten, die den größeren, weniger beweglichen Komplex einer Nukleinsäuresonde darstellt, die an ein Protein gebunden ist, das auf dem Gel "verschoben" ist (da hat es sich langsamer bewegt).

Unter den richtigen experimentellen Bedingungen wird die Wechselwirkung zwischen DNA (oder RNA) und Protein stabilisiert und das Verhältnis von gebundener zu ungebundener Nukleinsäure im Gel spiegelt die Fraktion der freien und gebundenen Sondenmoleküle wider, wenn die Bindungsreaktion in das Gel eintritt . Diese Stabilität ist zum Teil auf einen "Caging-Effekt" zurückzuführen, da das von der Gelmatrix umgebene Protein vor der Rekombination nicht von der Sonde weg diffundieren kann. ^[5] Wenn die Ausgangskonzentrationen von Protein und Sonde bekannt sind, und wenn die Stöchiometrie des Komplexes bekannt ist, kann die offensichtliche Affinität des Proteins für die Nukleinsäuresequenz bestimmt werden. ^[6] Sofern der Komplex nicht unter Gelbedingungen sehr lange lebt oder die Dissoziation während der Elektrophorese berücksichtigt wird, wird die Anzahl berücksichtigt abgeleitet ist ein scheinbarer Kd. Wenn die Proteinkonzentration nicht bekannt ist, aber die komplexe Stöchiometrie ist, kann die Proteinkonzentration bestimmt werden, indem die Konzentration der DNA-Sonde erhöht wird, bis weitere Inkremente den Anteil des gebundenen Proteins nicht erhöhen. Durch Vergleich mit einem Satz von Standardverdünnungen des freien Sondenlaufs auf dem gleichen Gel kann die Anzahl der Proteinmole berechnet werden. ^[4]

Varianten und Zusätze [ edit

Ein Antikörper Das erkennt, dass das Protein zu dieser Mischung hinzugefügt werden kann, um einen noch größeren Komplex mit einer größeren Verschiebung zu erzeugen. Diese Methode wird als Supershift Assay bezeichnet und wird verwendet, um ein Protein eindeutig zu identifizieren, das im Protein-Nukleinsäure-Komplex vorhanden ist.

Häufig wird eine zusätzliche Spur mit einem Kompetitor-Oligonukleotid gefahren, um die günstigste Bindungssequenz für das Bindungsprotein zu bestimmen. Die Verwendung verschiedener Oligonukleotide definierter Sequenz ermöglicht die Identifizierung der genauen Bindungsstelle durch Konkurrenz (nicht im Diagramm gezeigt). Varianten des Kompetitionsassays sind nützlich zur Messung der Spezifität der Bindung und zur Messung der Assoziations- und Dissoziationskinetik. Daher könnte EMSA auch als Teil eines SELEX-Experiments verwendet werden, um Oligonukleotide auszuwählen, die tatsächlich ein bestimmtes Protein binden. ^[7]

Nachdem die DNA-Protein-Bindung in vitro bestimmt wurde kann eine Reihe von Algorithmen die Suche nach der Identifizierung des Transkriptionsfaktors einschränken. Consensus-Sequenz-Oligonukleotide für den interessierenden Transkriptionsfaktor können um die Bindung konkurrieren, wodurch die verschobene Bande eliminiert wird, und müssen durch Supershift bestätigt werden. Wenn die vorhergesagte Konsensussequenz nicht um die Bindung konkurrieren kann, kann die Identifizierung des Transkriptionsfaktors durch die Multiplex-Kompetitor-EMSA (MC-EMSA) unterstützt werden, wodurch große Mengen an Konsensussequenzen in jeder Reaktion multiplext werden und eine Gruppe für die Bindung konkurriert Einzelne Konsensussequenzen aus diesem Satz laufen in einer weiteren Reaktion ab: ^[8]

Zur Veranschaulichung wird das Nukleinsäurefragment üblicherweise mit einem radioaktiven, fluoreszierenden oder Biotin-Marker markiert. Die Standard-Ethidiumbromidfärbung ist weniger empfindlich als diese Verfahren und es kann die Empfindlichkeit zum Nachweis der Nukleinsäure fehlen, wenn geringe Mengen an Nukleinsäure oder einzelsträngigen Nukleinsäuren in diesen Experimenten verwendet werden. Bei Verwendung einer Biotinmarkierung wird Streptavidin, das an ein Enzym wie Meerrettichperoxidase konjugiert ist, zum Nachweis des DNA-Fragments verwendet. ^[9][10] Während die isotopische DNA-Markierung die Proteinbindungsaffinität nicht oder nur unwesentlich beeinflusst, werden nichtisotopische Markierungen wie Flurophoren oder Biotin verwendet kann die Affinität und / oder Stöchiometrie der interessierenden Proteininteraktion verändern. Eine Konkurrenz zwischen einer mit Fluorophor oder Biotin markierten Sonde und nicht markierter DNA der gleichen Sequenz kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Markierung die Bindungsaffinität oder Stöchiometrie ändert.

Referenzen [ edit ]

1. ^ Granadino B, Penalva LO, MR MR, Valcarcel J., Sanchez L. 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7343-8
2. Garner MM, Revzin A (Juli 1981). "Gelelektrophoreseverfahren zur Quantifizierung der Bindung von Proteinen an spezifische DNA-Regionen: Anwendung auf Komponenten des Escherichia coli-Lactoseoperon-Regulationssystems". Nucleic Acids Res . 9 (13): 3047–60. doi: 10.1093 / nar / 9.13.3047. PMC 327330 . PMID 6269071.
3. ^ Fried M. Crothers DM (Dezember 1981). "Gleichgewichte und Kinetiken der Interaktionen von lac-Repressor-Operatoren durch Polyacrylamidgelelektrophorese". Nucleic Acids Res . 9 (23): 6505–25. doi: 10,1093 / nar / 9,23,6505. PMC 327619 . PMID 6275366.
4. ^ ^{a b} Ausubel, Frederick M. (1994). Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie . Chichester: John Wiley & Sons. S. 12.2.1–11. ISBN 0-471-50337-1
5. ^ Fried MG, Liu G. (1994). "Molekulare Sequestrierung stabilisiert CAP-DNA-Komplexe während der Polyacrylamidgelelektrophorese". Nucleic Acids Research 22 (23): 5054-5059. doi: 10.1093 / nar / 22.23.5054. PMID 7800499.
6. ^ Fried MG (1989) "Messung von Protein-DNA-Interaktionsparametern durch Elektrophorese-Mobilitätsverschiebungsassay". Elektrophorese 10, 366–376. PMID 2670548.
7. ^ Li, Shaohua; Li, Hui; Yang, Xiqin; Wang, Wei; Huang, Aixue; Li, Jie; Qin, Xingliang; Li, Fei; Lu, Guanyi (2015-03-12). "Vasorin ist ein potenzieller Serum-Biomarker und Wirkstoffziel eines Hepatokarzinoms, das mit dem subtraktiven EMSA-SELEX für das klinische Patientenserum gescreent wurde." Oncotarget . 6 (12). doi: 10.18632 / oncotarget.3541. ISSN 1949-2553.
8. ^ Smith AJ, Humphries SE (Januar 2009). "Charakterisierung von DNA-bindenden Proteinen unter Verwendung von Multiplex-Kompetitoren EMSA". J. Mol. Biol . 385 (3): 714–7. Doi: 10.1016 / j.jmb.2008.11.035. PMID 19059416.
9. ^ Hellman, Lance M; Fried, Michael G. (2007). "Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) zum Nachweis von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen". Nature Protocols . 2 (8): 1849–1861. Doi: 10.1038 / nprot.2007.249. ISSN 1754-2189. PMC 2757439
10. ^ Osmosensing und Osmosignaling . Akademische Presse. 1. Oktober 2007. S. 288–. ISBN 978-0-08-055211-8.

Externe Links [ edit ]